塑料作為一種廣泛應用于生活中的材料，其優異的性能特點如重量輕、加工性好、耐用性強以及低成本等，使其成為不可或缺的日用品。然而，傳統的石油基塑料由于難以降解，在大量使用和廢棄的過程中，造成了嚴重的環境污染問題，引發了人們的廣泛關注。因此，生物工程師們一直在努力開發可替代石油基塑料的生物降解性塑料。

其中，聚羥基烷酸酯(PHAs)作為一種可生物降解的聚合物，受到了廣泛關注和研究。PHAs是由多種微生物合成并在細胞內積累的聚合物，可作為碳、能量和還原力的儲存材料。與傳統的石油基塑料相比，PHAs具有良好的生物降解性，在環境中能夠被微生物分解，不會對生態環境造成長期污染。然而，天然產生的PHAs并不能完全滿足當代塑料市場的性能需求，如機械強度、熱穩定性等方面存在一定的局限性。為此，人們致力于通過修改PHAs的單體組成或引入新型單體來豐富其性能特點，使其能夠更好地替代傳統塑料。

引入芳香族側鏈單體是一個頗有前景的研究方向，芳香族側鏈相芳烴可以提高PHAs的熱穩定性，從而實現更廣泛的應用。這些含有芳香族重復單元的PHAs，有望取代傳統的不可生物降解的石油基芳香族塑料，如聚苯乙烯（PS）和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等。

然而，目前對芳香族PHAs的研究與脂肪族PHAs相比仍處于相對初級階段，主要存在以下兩個方面的挑戰：

一、缺乏關于產生芳香族羥基輔酶A的代謝途徑的知識。芳香族羥基輔酶A是PHAs聚合的必要中間體，但目前對其代謝機制的了解還比較有限。

二、能夠聚合芳香單體的PHA合成酶在自然界中比它們的脂肪類合成酶要少得多。這使得芳香族PHAs的生產主要依賴于向培養基中添加相應的芳香族前體，而這些前體通常是有毒且昂貴的。

在這項研究中，研究人員通過以下三種策略對大腸桿菌進行代謝工程改造，以生產聚(PhLA)并顯著提高聚(3HB-co-PhLA)的產量。

首先，在一株大腸桿菌菌株中建立了一條由葡萄糖合成聚(PhLA)的代謝途徑。同時，通過引入來自天然生產PHA的生物體的PHA顆粒結合蛋白，提高了這種芳香族聚酯的積累。

其次，對大腸桿菌的中心碳代謝和山梨酸途徑進行代謝工程改造，以增加向PhLA的代謝通量。通過進一步的基因修飾，基于多次批次發酵的結果，開發出一株最優化的大腸桿菌菌株。

最后，通過對關鍵的聚合酶PHA合酶PhaC1437進行工程改造，以提高聚(PhLA)的合成。

研究內容：

一、PhLA代謝途徑的構建

聚苯乳酸(poly(PhLA))的生產最初是基于大腸桿菌(E. coli)XB201TBAF菌株實現的。該菌株通過兩個質粒建立了poly(PhLA)生產的代謝途徑:一個質粒用于增強向苯乳酸(PhLA)的代謝通量，另一個質粒用于建立PhLA聚合的代謝途徑。這種改造菌株被命名為TBAFp，成功生產了poly(PhLA)，但積累量較低(2.56 ± 0.69 wt%)。

為了提高聚合物產量，他們引入了來自天然PHA生產菌的PHA顆粒結合蛋白(phasins)。phasins在PHA的形成、分裂和穩定化過程中起關鍵作用。選擇了三種代表性PHA生產菌株的phasins進行評估:C. necator的PhaP1、P. putida和P. oleovorans的PhaI。結果顯示，表達P. oleovorans phaI和P. putida phaI的菌株，其聚(PhLA)的滴度和含量均有所增加。

為進一步提高聚合物積累，他們調節了phasins基因的表達。在C. necator中，PhaR可以結合到phaP1的上游區域調控其表達；在P. putida和P. oleovorans中，PhaF具有DNA結合域和PHA顆粒結合域。他們分別表達了phaR、phaP1和phaR、phaIF操縱子，發現共表達這些基因的菌株聚合物產量和含量明顯提高。尤其是表達P. putida PhaIF操縱子的菌株，生產了0.28 ± 0.02 g/l的聚(PhLA)，PHA含量為19.59 ± 1.22 wt%。

他們還嘗試使用合成Anderson啟動子來表達表殼蛋白基因，但未觀察到聚合物積累的顯著增加。目前，通過額外表達phaR或phaF進行基因調控是提高聚(PhLA)積累的最有效方法。因此，選擇攜帶P. putida PhaIF操縱子的TBAFp菌株(命名為TBAFpp)進行進一步研究。在TBAFpp菌株的補料分批發酵中，產生了0.8 ± 0.0 g/l的聚(PhLA)，PHA含量為11.2 wt%。

因此，通過引入phasins基因并對其表達進行調控，成功地提高了大腸桿菌生產聚苯乳酸的能力。這為未來進一步優化和工業化生產聚苯乳酸奠定了基礎。

二、優化PhLA代謝通量

首先，研究人員構建了一種不需要氨基酸補充即可生長的TLF菌株，并通過調控aspC和tyrB基因的表達來提高PhLA的產量。TLF17B菌株經過優化后，在無需氨基酸補充的情況下，PhLA產量達到了0.63 g/L，超過了需要氨基酸補充的原始菌株。

進一步，研究人員構建了TLF17Bpp菌株，能夠生產含有20.31 wt%聚苯乳酸的聚羥基脂肪酸(PHA)。在發酵過程中，該菌株的聚苯乳酸產量達到了2.0 g/L，明顯高于需要氨基酸補充的原始菌株。

為了實現無誘導劑生產，研究人員構建了TLF17BP菌株，通過整合pheA^fbr基因到基因組中，實現了對聚苯乳酸生物合成通路的代謝調控。該菌株在無需IPTG和氨基酸補充的條件下，聚苯乳酸產量達到了2.3 g/L，PHA含量為13.6 wt%。

最后，通過增強PEP合酶的表達和敲除pykF基因，進一步提高了碳通量向shikimate通路的流向，構建了TLF17BPApp菌株。該菌株在發酵條件下，聚苯乳酸產量達到了2.7 g/L，PHA含量為24.32 wt%，顯著優于前述菌株。

PHA合成酶工程

為進一步提高聚合物的生產，研究人員對PHA合成酶(PhaC)進行了工程改造，以增強其聚合能力。之前的研究主要集中在修改PhaC以生產具有特定單體組成的PHA，包括poly(3-羥基丁酸-co-中鏈3-羥基烷酸)、PLA和poly(3-羥基丁酸-co-乳酸)。由于用于生產poly(PhLA)的PhaC1437的3D結構尚未知，研究人員采用了基于預測3D結構的理性突變方法，成功地進化了PhaC1437，使其更適合于PhLA的聚合。

具體來說，研究人員首先利用同源建模方法預測了PhaC1437的3D結構，然后通過分子動力學模擬和對接模擬，識別出20個潛在的有益突變位點。將這些突變體在體內進行測試后，發現PhaC1437(T259G)、PhaC1437(M495E)和PhaC1437(N469Q)三個突變體在poly(PhLA)的積累方面優于原始PhaC1437。進一步的分析表明，這些突變位點都位于活性位點附近，但并未直接位于PhLA-CoA的結合界面。這些突變可能通過改善酶的熱穩定性或擴大底物結合口袋來提高催化效率。

為進一步提高poly(PhLA)的生產，研究人員進行了突變組合，發現PhaC1437(T259G/M495E)雙突變體在流加培養發酵中可以產生最高32.05±1.47 wt%的poly(PhLA)。此外，通過優化供料策略和代謝工程，研究人員還進一步提高了PhLA和poly(PhLA)的生產水平，最高分別達到11.0 g/L和12.3±0.1 g/L，這是目前最高的報道水平。

為探索是否可以同樣提高poly(3HB-co-PhLA)的生產水平，研究人員構建了3HB單元聚合的代謝通路，引入了C. necator的PhaA和PhaB兩種異源酶，可以將兩分子乙酰輔酶A轉化為3HB-CoA。之前的研究表明，3HB-CoA可以與PhLA-CoA被PhaC1437共聚合成poly(3HB-co-PhLA)。

鑒于PhaC1437(T259G/M495E)是PhaC1437的改造突變體，研究人員預期它也能夠共聚3HB-CoA和PhLA-CoA。因此，他們構建了TLF17BPAppTMAB菌株，在TLF17BPAppTM菌株的基礎上，額外表達了phaA和phaB基因。在流加培養發酵中，該菌株可以生產49.7±1.0 g/L的poly(3HB-co-13.7 mol% PhLA)和55.2±1.6 g/L的poly(3HB-co-19.7 mol% PhLA)。

進一步地，研究人員將之前最優的poly(PhLA)生產菌株TLF17BPALppTM，也改造成了能夠生產poly(3HB-co-PhLA)的TLF17BPALppTMAB菌株。在流加培養發酵中，該菌株可以生產61.4±0.0 g/L的poly(3HB-co-11.7 mol% PhLA)，這是目前報道的最高芳香聚酯產量。在30 L發酵罐中的放大試驗也驗證了該結果，可以生產40.5±1.1 g/L的poly(3HB-co-16.7 mol% PhLA)。

對所得到的聚合物進行了表征，發現其分子量分布、玻璃化轉變溫度和楊氏模量等性能指標，與商業聚合物如PBT相當，顯示了良好的材料特性。

結論：

這項研究成功實現了大腸桿菌對不相關碳源的芳香聚酯的代謝工程生產，包括同源芳香族聚酯和芳香共聚酯，克服了之前芳香聚酯生產受限于單體供應不足、聚合效率低、以及在非天然PHA生產菌中積累困難等問題。

通過引入天然PHA生產菌的phasin蛋白、基因組工程重定向碳通量、理性改造PhaC酶等措施，大幅提高了芳香聚酯的生產水平，實現了目前最高的產量記錄。

所生產的生物降解芳香聚合物具有廣泛應用前景，可替代傳統芳香聚合物，并應用于生物醫用領域，其中最高產量的poly(3HB-co-PhLA)有望替代PBT等常用塑料，而非晶態低分子量的poly(PhLA)則適合用于藥物遞送系統；基于本研究建立的代謝工程菌株，還可進一步開發包含PhLA在內的各種新型芳香共聚酯，滿足不同應用需求。

具有廣闊的應用前景，這項研究在芳香聚酯的生物合成和應用方面取得了重要突破，為生物基可降解塑料的實際應用奠定了基礎。

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